El capítulo II describe el desarollo de un método inmuno-enzimático, basado en un anticuerpo monoclonal murino (139H2) dirigido contra la secuencia PDTR contenida en el tándem repetido de MUC1, para la detección de inmunocomplejos circulantes que contienen MUC1 (PEM.CIC). Los anticuerpos unidos a la mucina circulante se detectan con inmunoglobulina de cabra anti-immunoglobulina humana (G + M + A) conjugada a la peroxidasa. Los inmunocomplejos circulantes (CICs) que contienen MUC1 fueron detectados en el suero de 151 pacientes (24,5%) con carcinoma primario de mama, y en 18% y 21,4% de pacientes con carcinoma avanzado de mama (n = 61) y de ovario (n = 56), respectivamente. También se detectaron en 37% de pacientes con tumores benignos de mama, pero sólo en 2,1% de 96 individuos sanos.

El estudio contenido en el capítulo III investiga el significado clínico de la presencia de inmunocomplejos que contienen MUC1 en muestras de suero obtenidas pretratamiento en 140 pacientes con cáncer de mama. Las mediciones efectuadas en 96 mujeres sanas condujeron a la definición de un nivel máximo de normalidad, de 120 Unidades de Densidad Optica (OD) ´ 103, que excluía al 98% de la población sana. En pacientes con cancer de mama, hallamos una correlación negativa entre positividad para PEM.CIC y la extensión de la enfermedad en el momento del diagnóstico: la mayor frecuencia de positividad para PEM.CIC se encontró en pacientes con un carcinoma in situ, mientras que todas las pacientes con metástasis a distancia eran PEM.CIC negativas. Sólo una de 15 pacientes con tumor en más de 5 ganglios linfáticos axilares tenía niveles positivos de PEM.CIC en el suero pretratamiento. Veintitres de 28 pacientes que sufrieron una recurrencia durante el período de observación eran PEM.CIC negativas. Durante el período de seguimiento, ninguna de las pacientes con niveles pretratamiento concomitantemente elevados de CA 15.3 y de PEM.CIC sufrió recurrencias. Estos resultados preliminares, obtenidos en un grupo pequeño de pacientes, sugieren que una respuesta inmune humoral anti-MUC1 protege contra la progresión de la enfermedad.

En el capítulo IV describimos el desarrollo de un método inmuno-enzimático para la cuantificación de anticuerpos libres circulantes dirigidos contra el antígeno MUC1. Este procedimiento se ha convertido en una herramienta útil para la detección de respuestas humorales naturales anti-MUC1 y para el monitoreo de inmunoterapias con vacunas basadas en el antígeno MUC1. El ensayo está basado en la utilización de un triple tándem repetido del péptido MUC1 conjugado a BSA. Elegimos un péptido de esta extensión basados en estudios llevados a cabo por otros grupos que demostraron que la región inmunogénica para el ratón, PDTRP, alcanza su conformación nativa en péptidos de más de dos tándem repetidos. En un total de 492 muestras séricas, obtenidas de 40 hombres sanos y 201 mujeres sanas, de 62 mujeres con tumores benignos de la mama y de 190 pacientes con cáncer de mama, antes del tratamiento primario, evaluamos la presencia de inmunoglobulinas G o M unidas al péptido de captura, utilizando inmunoglobulina de conejo anti-inmunoglobulina humana G o M marcadas con peroxidasa como trazador. Los anticuerpos circulantes contra el antígeno MUC1 se encuentran presentes tanto en sujetos sanos como en pacientes con cáncer de mama. Luego de establecidas las condiciones estándar de desarrollo del método, analizamos sus características analíticas. Los coeficientes de variación (CV) intra e inter ensayo fueron de 2% y 12%, respectivamente, para las determinaciones de IgG y de 1,2% y 3% para las determinaciones de IgM. Los coeficientes de correlación para muestras séricas diluídas serialmente variaron entre 0,9998 y 0,9920 para las determinaciones de IgG, y entre 0,9996 y 0,9818 para las determinaciones de IgM. La adición de varios péptidos MUC1 y de la mucina bloqueó parcialmente la reactividad de las muestras de suero. Los resultados obtenidos en los ensayos de inhibición utilizando peptidos del triple tándem repetido con modificaciones de la secuencia sugieren la presencia de anticuerpos circulantes dirigidos contra más de un epitopo.

En el capítulo V analizamos la incidencia de anticuerpos séricos anti-MUC1 naturales en pacientes con estadíos tempranos de cáncer de mama, en muestras obtenidas antes del tratamiento primario, evaluando su relación con el desarrollo de la enfermedad. Ello podría indicar la posible utilidad del antígeno MUC1 para la immunoterapia de pacientes con adenocarcinomas. Medimos anticuerpos anti-MUC1 (IgG e IgM) con el procedimiento descrito en el capítulo IV, en muestras séricas obtenidas pretratamiento de 154 pacientes con cáncer de mama (52 con estadío I y 102 con estadío II) y de 302 controles sanos. En las pacientes con cáncer de mama la sobrevida media ligada a la enfermedad fue de 74 meses (rango entre 15 y 118 meses). Definimos un resultado positivo como los niveles de anticuerpo anti-MUC1, IgG o IgM, iguales o mayores que las medianas correspondientes obtenidas en el total de la población de pacientes de cáncer de mama. Observamos que un resultado positivo concomitante para anticuerpos anti-MUC1 IgG e IgM en el suero pretratamiento se asoció significativamente con una mejor sobrevida ligada a la enfermedad, en los pacientes con estadío I y II (P = .0116). El análisis multivariado demostró que niveles positivos de anticuerpos anti-MUC1 IgG e IgM tenían valor prognóstico adicional al estadío (P = .0437). La probabilidad de sobrevida libre de la enfermedad no difirió significativamente. Sin embargo, aquellas pacientes con estadío II positivas para anticuerpos anti-MUC1 IgG e IgM, que sufrieron una recurrencia de la enfermedad, tuvieron predominantemente recurrencias locales o contralaterales, mientras que las pacientes con niveles negativos de anticuerpos anti-MUC1 sufrieron recurrencias a distancia (P = .026). Los resultados de este estudio retrospectivo indican que pacientes con estadío temprano de cáncer de mama y respuesta humoral al antígeno MUC1 tienen mayor probabilidad de permanecer libres de metástasis a distancia y una mejor sobrevida relacionada a la enfermedad. El posible papel que juegan los anticuerpos anti-MUC1 en el control de la diseminación hematógena del tumor y en su crecimiento, participando en la destrucción de células tumorales circulantes o sembradas a distancia que expresan MUC1, será investigado en un estudio propectivo de pacientes con cáncer de mama.

Los anticuerpos anti-MUC1 se detectan tanto en sujetos sanos como en pacientes con cáncer y pueden ser inducidos mediante la vacunación con péptidos de MUC1. El estudio contenido en el capítulo VI compara la especificidad de los anticuerpos anti-MUC1 naturales y de los inducidos, con el objetivo de definir una vacuna MUC1 efectiva para la inmunoterapia activa de pacientes con adenocarcinomas. Muestras séricas, seleccionadas por su alto contenido de anticuerpos anti-MUC1 IgG y/o IgM de una población de 492 individuos (capítulo IV), fueron obtenidas de 55 controles y de 26 pacientes con cáncer de mama, así como de 19 pacientes con cáncer de mama que formaban parte en dos protocolos de fase I de vacunación (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, NY) con péptidos MUC1 [conjugados a la hemocianina de calamar (KLH) y mezclados con QS21]. Utilizando un método inmuno-enzimático, evaluamos la reactividad de las muestras con (a) péptidos superpuestos de 7 y 20 aminoácidos, cubriendo la secuencia del tándem repetido de MUC1; (b) 2 péptidos modificados de 60 aminoácidos, uno con substitución en la secuencia PDTR (PDTA) y otro en la secuencia STAPPA (STAAAA) de cada tándem repetido; (c) cuatro glicopéptidos de 60 aminoácidos con una, dos, tres o cinco moléculas de N-acetilgalactosamina (GalNAc) por tándem repetido, respectivamente. Detectamos la presencia de más de una secuencia epitópica mínima en 13/31 muestras anti-MUC1 IgG positivas y en 5/18 muestras anti-MUC1 IgM positivas, lo cual indica que un mismo sujeto puede tener anticuerpos anti-MUC1 dirigidos a más de una secuencia del núcleo peptídico de la molécula de MUC1. RPAPGS constituyó la secuencia epitópica mínima más frecuentemente reconocida por los anticuerpos anti-MUC1 IgG e IgM naturales, seguida por PPAHGVT y PDTRP. La vacunación con péptidos MUC1 indujo títulos elevados de anticuerpos IgM e IgG predominantemente dirigidos a las secuencias PDTRPAP y STAPPAHGV del tándem repetido, respectivamente. Los anticuerpos anti-MUC1 naturales provenientes de pacientes con cáncer de mama mostraron una reactividad más elevada con los glicopéptidos que con el péptido de 60 aminoácidos no glicosilado. Por el contrario, los anticuerpos IgG e IgM inducidos por la vacunación con péptidos MUC1 mostraron una reactividad con los glicopéptidos significativamente reducida (P < .0001). Los resultados de este estudio indican que, mientras que en los pacientes con cáncer los carbohidratos parecen participar en la conformación del epitopo, los anticuerpos inducidos por la vacunación con péptidos MUC1 reconocen epitopos que ya han sido enmascarados por una glicosilación mínima del péptido. Considerando que la mucina asociada a tumores, aunque en forma reducida, está glicosilada, concluímos que la vacuna óptima no es un péptido del MUC1 sino un glicopéptido. Un buen substrato para vacunación podría ser un péptido MUC1 de 33 aminoácidos con la secuencia RPAPGS en la parte C-terminal y con GalNAcs unidas a la treonina en la secuencia PDTR y a la serina y treonina en la secuencia STAPPA del tándem repetido.

El capítulo VII explora la presencia de respuestas proliferativas de células T al antígeno MUC1 y sus tándem repetidos en células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC), obtenidas de pacientes con cáncer de ovario y de controles, correlacionando las respuestas celulares con las de tipo humoral anti-MUC1. Sólo una de 6 mujeres sanas mostró una débil respuesta proliferativa primaria (índice de estimulación, SI < 2) frente al tándem repetido de 20 aminoácidos de MUC1, en la presencia de interleuquina-2 (IL-2). Una respuesta débil pudo ser inducida en PBMC de 5/13 mujeres grávidas, con el péptido de 20 aminoácidos y/o el péptido de 60 aminoácidos con la secuencia del tándem repetido de MUC1 (SI < 3). Respuestas primarias al péptido de 20 aminoácidos y/o al péptido de 60 aminoácidos con la secuencia del tándem repetido de MUC1 (SI £ 5.4) pudieron ser inducidas en PBMC de 8/15 pacientes con cáncer de ovario (53%). Preparados de mucina MUC1 purificada ejercieron un efecto proliferativo relativamente alto (SI £ 19) sobre PBMC en 4/16 pacientes con cáncer de ovario (25%). En contraste con este hallazgo, la mucina MUC1 ejerció un efecto inhibitorio fuerte sobre la proliferación de PBMC, obtenidos de 9 pacientes con cáncer de ovario, estimulados con extractos de Candida albicans. Esta inhibición pudo ser revertida parcialmente por la adición de IL-2. Los niveles de MUC1 y de anticuerpos anti-MUC1 circulantes fueron significativamente más altos en las pacientes con cáncer de ovario que en las mujeres sanas. Aunque no se encontraron correlaciones significativas entre los niveles de mucina MUC1 y de anticuerpos anti-MUC1 con las respuestas proliferativas individuales, es posible que exista una asociación entre ellos, ya que los tres estaban significativamente elevados en las pacientes con cáncer de ovario en comparación con las mujeres sanas.

En el capítulo VIII se discuten los resultados de los estudios presentados en esta tesis en conjunción con algunas formas de inmunoterapia del cáncer.